环境科学学报
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碳纳米材料在聚合酶链式反应中的研究进展

  摘 要:聚合酶链式反应(PCR)是现代分子生物学的核心技术之一,提高PCR扩增效率具有重要意义,传统方法具有众多局限性。碳纳米材料具有纳米材料特殊的性质,易与生物大分子蛋白质、核酸相互作用,对PCR扩增效率的提高具有重要的应用价值和理论意义。


  关键词:聚合酶链式反应;碳纳米材料;特异性1 引言聚合酶链式反应(PCR)能够在体外扩增DNA,并能使微量的模板在数小时内以指数形式扩增数百万倍。在实际运用中,PCR技术还存在如假阳性、假阴性、扩增效率低等问题。为解决上述问题,科学家们主要从三个方面进行尝试和努力:一是调整PCR的参数,如调整聚合酶的种类或浓度、Mg2+浓度退火温度等;二是引入不同类型的添加剂对PCR体系进行优化,比如甲酰胺、 二甲基亚砜、海藻糖[1-3]等;三是改进PCR扩增策略,如热启动PCR、巢式PCR、降落PCR等从传统PCR衍生出的策略。


  碳纳米材料是指分散相尺度至少有一维小于100nm的碳材料。碳纳米材料按形态主要包括四种类型:片状(石墨烯),管状(碳纳米管),纤维状(碳纳米纤维)、球状(纳米碳球) 是目前应用非常广泛的一类纳米材料。碳纳米材料能够与生物分子发生复杂的相互作用,因此很多学者将碳纳米材料引入PCR反应中,提高PCR反应的产量和特异性,拓展PCR技术的应用范围。


  2 碳纳米材料在PCR中的应用2.1 碳纳米管在PCR中的应用2004年,Cui等[4]发现单壁纳米碳管(SWCNTs)可优化PCR反应。当PCR体系中的SWCNTs浓度低于3μg/μL时,产物的产量增加。SWCNTs的作用类似Mg2+,加入SWCNTs后即使反应液中无Mg2+,也不影响扩增。作者推测PCR各组分和SWCNTs充分接触后发生作用,提高PCR的反应产物的产量。XPS表明PCR反应后SWCNTs的C1s结合能增加,证实在PCR反应中SWCNTs与DNA模板、Taq聚合酶发生了强烈的相互作用,SWCNTs与PCR各组分之间发生了电子转移,SWCNTs的作用类似Mg2+,使Taq聚合酶保持高的反应活性。


  2008年,Zhang等[5]研究了单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)对于Long PCR扩增特异性的影响。在PCR体系中添加不同管径的SWCNTs 和MWCNTs,调节体系中碳纳米管的浓度为0.8~1.6 mg/mL,扩增长度为14.3 kb 的DNA片断,可以提高PCR反应的特异性和产率。作者认为PCR效率提高是因为碳纳米管具有良好的导热性,而不是与PCR组分相互作用的结果。


  2.2 碳纳米粉在PCR中的应用2007年,Zhang等[6]将纳米碳粉(CNP)的悬浮液加入PCR体系,提高了多轮PCR和Long PCR的特异性。加入CNP后,在第6轮扩增中得到单一的目标条带。无CNP时,第4轮扩增开始出现非特异性条带,第5轮扩增几乎无目标条带。在Long PCR中,CNP显著减少非特异性条带。原子力显微镜表明CNP与双链DNA发生作用,使引物和未完全退火的DNA结合在CNP上,阻止引物与DNA模板之间发生错配,减少引物二聚体的产生。


  2.3 石墨烯在PCR中的应用2012年,米丽娟等[7]研究了氧化石墨烯(GO)在PCR中的应用,发现添加0.2-2.5ng/μL GO可显著提高PCR的特异性和扩增产量,添加1ng/μL GO时,产量的提升尤为显著,产率达对照组的250%。在模板来源不同、浓度不同的PCR体系中分别加入 GO,发现添加GO的实验组灵敏度提高了1-3个数量级,并显著消除了引物二聚体,证明GO适用于各种浓度和复杂程度的DNA模板,甚至在模板量低于102拷贝数时也适用。


  2012年,我们[8]研究了氧化石墨烯(GO)和还原石墨烯(rGO)对于多轮PCR反应特异性的影响。在两轮PCR中,GO的终浓度介于12-60μg/mL时明显提高第一轮PCR产物的特异性;以第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增,GO在上述浓度内无法提高PCR产物的特异性。然而,rGO在两轮PCR中,终浓度为10-12μg/mL时显著提高了PCR产物的特异性。此外,利用9轮PCR证实RGO对PCR特异性的影响,各轮PCR中加入12μg/mL rGO,对照组从第4轮开始已基本得不到产物,实验组甚至在8轮PCR反应后依然能够得到产物。还证实降低退火温度至25℃的情况下,加入rGO的PCR体系依然得到清晰的产物带。我们认为主要是石墨烯与pfu聚合酶的相互作用,负电位较弱的rGO与pfu聚合酶形成带正电的复合物,吸引带负电的DNA模板和引物到rGO的表面发生退火和延伸,降低非特异性反应的发生。


  3 总结与展望将纳米材料引入PCR反应提高了PCR反应的特异性和产量,拓宽了PCR技术的应用范围。今后,则要尝试解决长片段、GC富集模板等复杂体系的扩增问题,并在RT-PCR等相关技术中促进纳米碳材料的辅助应用。


  参考文献:


  [1]G.Sarkar, et al.Nucleic Acids Res., 1990(18):7465.


  [2]P.R.Winship.Nucleic Acids Res., 1989(17):1266.


  [3]A.N.Spiess,et al.Clinical Chemistry,2004(50):1256-1259.


  [4]D.X.Cui, et al. Nanotechnology, 2004(15):154-157.


  [5]Z.Z.Zhang, et al. BioTechniques, 2008(44):537-545.


  [6]Z.Z.Zhang,et al. Nanotechnology, 200(l8):355706.


  [7]米丽娟等。 CN102465163A, 2012-05-23.


  [8]Jing Jia, et al. Small, 2012(08):2011-2015.


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